Verkningsmekanismen är hämning av proteinsyntesen genom att binda till 30S ribosomal subenhet hos mikroorganismer som är känsliga för
oxytetracyklin, varigenom
vilket förhindrar kopplingen mellan ribosomer och aminoacyl-tRNA. Man tror också att oxytetracyklin omvänt binder till 50S-ribosomer och förändrar permeabiliteten hos det cytoplasmatiska membranet hos känsliga mikroorganismer. Oxytetracyklin kan, vid höga koncentrationer, också hämma proteinsyntesen i celler.